1.3 药品与试剂

盐酸万古霉素（批号WXBD3403V）、氨苄青霉素（批号BCCC0880）、硫酸新霉素（批号WXBD3833V）、甲硝唑（批号MKCJ4156）、两性霉素B（批号V900919）购自美国Sigma-Aldrich公司。

1.4仪器

DYY-8C型电泳仪（北京六一生物科技有限公司）；4375786型PCR仪（美国Thermo Fisher Scientific公司）；GenoSens 1850型凝胶成像仪器（上海勤翔科学仪器有限公司）；CBM-40型岛津超高效液相色谱仪（日本岛津公司）；ZenoTOF 7600型高分辨质谱（美国SCIEX公司）。

2方法

2.1铁皮石斛榨汁的UPLC-QTOF-MS/MS分析

2.1.1供试品溶液的制备称取铁皮石斛分离茎10 g，加100 mL蒸馏水榨汁，抽滤得榨汁液。取一半榨汁液121 ℃高压灭菌40 min。榨汁液经0.22 μm的微孔滤膜滤过，即得供试品溶液，每组平行设置3个重复，放置4 ℃冰箱备用。

2.1.2色谱条件Waters Acquity UPLC®HSST3 C18色谱柱（100 mm×2.1 mm，1.8 µm），流动相为乙腈（A）-0.1%甲酸水溶液（B），梯度洗脱：0～5.0 min，5% A；5.0～25.0 min，5%～95% A；25.0～30.0 min，95% A；30.0～30.1 min，95%～5% A；30.1～35.0 min，5% A；柱温40 ℃；体积流量1.3 mL/min；进样量2 μL。

2.1.3质谱条件正离子模式，电喷雾离子源，IDA扫描；离子喷雾电压5500 V；去簇电压60 V；碰撞电压35 eV；碰撞能量扩展10 eV；雾化气压力55 kPa；辅助加热气压力55 kPa；气帘压力35 kPa；去溶剂温度500 ℃；扫描范围m/z 50～1200。

2.1.4数据分析采用UPLC-QTOF-MS/MS技术对高压灭菌前后的铁皮石斛新鲜榨汁成分进行定性分析，通过查阅国内外文献、TCMSP数据库，建立铁皮石斛的质谱数据库，在误差小于5×10−6的条件下，利用QTOF/MS提供的精确相对分子质量与数据库比对，通过MassHunter数据软件和Chemspider网站进行数据的采集和分析。

2.2肠道菌群紊乱小鼠模型的建立、分组与给药

将盐酸万古霉素、氨苄青霉素、硫酸新霉素、甲硝唑和两性霉素B分别用无菌水配制成质量浓度为5.0、1.0、10.0、10.0、0.1 mg/mL的溶液，制成抗生素混悬液。C57小鼠随机分为对照组（6只）和造模组（18只），造模组ig抗生素混悬溶液（10 mL/kg），1次/d，连续7 d[17-18]。抗生素诱导肠道菌群紊乱后，造模小鼠随机分为模型组、铁皮石斛新鲜榨汁（0.5 g/kg，相当于临床等效剂量）组和铁皮石斛高压灭菌榨汁（0.5 g/kg，相当于临床等效剂量）组，每组6只。各给药组ig相应药物，对照组和模型组ig无菌水，1次/d，连续14 d。给药结束后，无菌采集每只小鼠的粪便，放入灭菌后的冻存管中并保存于−80℃冰箱，用于16S rDNA测序。

2.3 生物信息学分析

取铁皮石斛鲜品4份和粪便样品24份（每组6份），送上海美吉生物医药科技有限公司进行16S rDNA测序。参照陈文华等[19]方法进行DNA提取、PCR扩增及测序。采用Flash ver 1.2.3软件处理Paired-end Illumina MiSeq序列。有效数在97%相似水平上的分类操作单元（operational taxonomic unit，OTU）聚类分析采用Usearch ver 5.2.236处理[20]。采用Rver 3.2及Vegan软件对真菌群落的方差统计（ANOVA）、非度量多维标度（non-metric multidimensional scaling，NMDS）和线性判别分析（linear discriminant analysis，LDA）等分析[18]；采用PICRUSt1软件对内生细菌群落功能信息进行预测。

3 结果

3.1 铁皮石斛榨汁化学成分分析

采用UPLC-TOF-MS技术对高压灭菌前后的铁皮石斛新鲜榨汁成分进行定性分析，见表1、2。铁皮石斛新鲜榨汁检测出17种化合物，高压灭菌后铁皮石斛新鲜榨汁检测出14种化合物，这些成分在新鲜榨汁中均被检测出，共有成分峰面积占总成分的95.84%，缺失的成分为ephemeranthol A、erianthridin和densiflorol A。

3.2 测序结果

铁皮石斛鲜品、对照组、模型组、铁皮石斛新鲜榨汁组和铁皮石斛高压灭菌榨汁组检测到的平均有效片段分别为16 025、17 561、25 284、20 595和20 620个。从稀释曲线（图1）分析，随着测序reads数目的增加，铁皮石斛鲜品和小鼠肠粪便样品Shannon多样性指数的稀释曲线均基本趋于平缓，表明测序的深度能够基本覆盖到样品中所有的细菌物种，测序数据合理。

3.3 铁皮石斛对抗生素诱导小鼠肠道菌群多样性的影响

采用NMDS分析考察铁皮石斛对抗生素诱导小鼠肠道菌群的β多样性，结果见图2。样本坐标轴距离越接近，表明肠道菌群组成结构越相似。对照组和铁皮石斛新鲜榨汁组的样品距离较近，但与模型组和铁皮石斛高压灭菌榨汁组样品距离相对较远，表明铁皮石斛新鲜榨汁对抗生素诱导小鼠肠道菌群紊乱有改善作用，但铁皮石斛高压灭菌榨汁对抗生素诱导小鼠肠道菌群紊乱无明显作用。

3.4 铁皮石斛对抗生素诱导小鼠肠道菌群群落组成的影响

如图3-A所示，在门水平上，小鼠肠道菌群组成为拟杆菌门（Bacteroidota）、厚壁菌门（Firmicutes）、变形菌门（Proteobacteria）、放线菌门（Actinobacteriota）、脱硫菌门（Desulfobacterota）、Deferribacterota和弯曲杆菌门（Campilobacterota）。对照组和模型组主要以拟杆菌门和厚壁菌门为优势菌门，铁皮石斛新鲜榨汁组和铁皮石斛高压灭菌榨汁组主要以拟杆菌门、厚壁菌门和变形菌门为优势菌门。

如图3-B所示，在属水平上，对照组前3位的优势菌属分别为拟杆菌属Bacteroides（4.79%）、瘤胃球菌属Ruminococcus（7.39%）和Eubacterium_ xylanophilum_group（4.70%）；模型组前3位的优势菌属分别为蓝绿藻菌属Lachnoclostridium（12.60%）、脱硫弧菌属Desulfovibrio（4.41%）和拟杆菌属（9.44%）；铁皮石斛新鲜榨汁组前3位的优势菌属分别为乳酸杆菌属Lactobacillus（14.23%）、双歧杆菌属Bifidobacterium（7.50%）和蓝绿藻菌属（6.34%）；铁皮石斛高压灭菌榨汁组前3位的优势菌属分别为蓝绿藻菌属（10.84%）、副萨特氏菌属Parasutterella（12.77%）和Eubacterium_ xylanophilum_group（11.62%）。

3.5 铁皮石斛对抗生素诱导小鼠肠道优势菌群的差异性分析

铁皮石斛榨汁对抗生素诱导小鼠肠道优势菌群的LEfSe分析见图4，4个组别共有20个具有显著差异的细菌分类群，其中对照组14个、模型组11个、铁皮石斛新鲜榨汁组12个、铁皮石斛高压灭菌榨汁组11个。在属水平上，对照组的差异性优势菌属是瘤胃球菌属和Eubacterium_xylanophilum_ group；模型组的差异性优势菌属是脱硫弧菌属、拟杆菌属和另枝菌属；铁皮石斛新鲜榨汁组的差异性优势菌属是乳杆菌属、双歧杆菌属、肠球菌属Enterococcus和Clostridium_innocuum_group；铁皮石斛高压灭菌榨汁组的差异性优势菌属是副萨特氏菌属、Escherichia-Shigella、Robinsoniella和摩根菌属Morganella。

3.6 铁皮石斛对抗生素诱导小鼠肠道菌群的PICRUSt1功能预测分析

通过GreenGene数据库注释的16S测序对小鼠粪便样品进行PICRUSt1功能预测分析，如图5所示，与对照组比较，模型组细胞周期控制、细胞分裂、染色体分裂，核苷酸转运和代谢，翻译、核糖体结构和生物发生，复制、重组和修复，细胞壁/膜/胞膜生物发生，翻译后修饰、蛋白质转换、伴侣，仅一般功能预测和细胞内运输、分泌和膀胱运输的相对丰度显著降低。与模型组比较，仅铁皮石斛新鲜榨汁组相对丰度显著升高的是核苷酸转运和代谢，翻译、核糖体结构和生物发生，复制、重组和修复，翻译后修饰、蛋白质转换、伴侣，仅一般功能预测和细胞内运输、分泌和膀胱运输。表明铁皮石斛新鲜榨汁可能通过提高这些功能活性来改善抗生素诱导的小鼠肠道菌群紊乱。

4 讨论

本研究采用UPLC-QTOF-MS/MS技术对铁皮石斛新鲜榨汁灭菌前后化学成分进行分析，发现灭菌后ephemeranthol A、erianthridin和densiflorol A缺失。ephemeranthol A、erianthridin和densiflorol A的峰面积占铁皮石斛榨汁成分的4.16%，其余14个共有成分占到95%以上。但是ephemeranthol A、erianthridin和densiflorol A目前没有调节肠道菌群的报道，查阅文献发现ephemeranthol A具有抗癌和抗炎的活性[21-22]，erianthridin具有抗癌作用[23]，后续将进行验证ephemeranthol A、erianthridin和densiflorol A是否具有调节肠道菌群作用。

稳定而有益的肠道菌群环境，有助于调节人体微环境平衡和相关免疫功能。肠道菌群失调会导致人体功能失调并伴发疾病，如心血管疾病、癌症、呼吸道、胃肠道疾病等[24]。本研究PCoA分析发现抗生素诱导小鼠肠道菌群与正常小鼠肠道菌群的群落组成差异明显，说明成功建立了抗生素诱导肠道菌群紊乱模型，这与之前的研究一致[15-18]。

近年来研究发现中药或益生菌可以通过增加有益菌群丰度和降低有害菌群丰度来调节肠道菌群，进而治疗疾病。铁皮石斛可以通过增加阿克曼菌属和副拟杆菌属的相对丰度调节肠道菌群来缓解II型糖尿病[25]。乳酸杆菌属Lactobacillus_fermentum_ CQPC04通过增加乳酸杆菌属和拟杆菌属等有益菌属的相对丰度来降低血栓性小鼠的氧化应激并缓解肠道炎症[26]。

与模型组比较，铁皮石斛新鲜榨汁组有益菌属乳酸杆菌属和双歧杆菌属的丰度显著升高，有害菌属脱硫弧菌属的丰度显著降低。研究发现，脱硫弧菌属是肠道中一种有害的致病菌，可以诱发结肠炎和高脂血症等疾病[27-28]；乳酸杆菌属Lactobacillus_ rhamnosus_GG可以通过调节肠道屏障和Treg/Th1缓解酒精性脂肪肝[29]；乳酸杆菌属可以提高小鼠的免疫力[30]；乳酸杆菌属Lactobacillus_salivarius_ CPU-01可以通过调节肠道菌群、改善肠道屏障和阻断促炎细胞因子来缓解替莫唑胺诱导的肠黏膜炎[31]；双歧杆菌属Bifidobacterium_bifidum_ TMC3115可以改善抗生素诱导小鼠肠道菌群紊乱引发的结肠炎[27]；双歧杆菌属作为肠道中有益菌群，其丰度降低会造成肥胖和衰老性疾病[32-33]。表明铁皮石斛新鲜榨汁可以通过提高有益菌属乳酸杆菌属、双歧杆菌属的丰度和降低有害菌属脱硫弧菌属的丰度改善抗生素诱导小鼠肠道菌群紊乱。

PICRUSt1功能预测表明铁皮石斛改善抗生素诱导小鼠肠道菌群紊乱，可能与核苷酸转运和代谢，翻译、核糖体结构和生物发生，复制、重组和修复，翻译后修饰、蛋白质转换、伴侣，仅一般功能预测和细胞内运输、分泌和膀胱运输等作用相关，后续将进行相关分子验证。综上，新鲜铁皮石斛可以通过上调有益菌群和下调有害菌群来改善抗生素诱导小鼠肠道菌群紊乱，为铁皮石斛用于改善胃肠道菌群的临床应用提供了参考依据。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突

参考文献（略）

来 源：陈文华，李思琦，宋 佳，於李龙，沈晓霞，朱 波，秦路平．铁皮石斛对抗生素诱导小鼠肠道菌群紊乱的改善作用 [J]. 中草药, 2023, 54(19):6362-6369.返回搜狐，查看更多